3. Phổ khối lượng
Một trong những phổ có ứng dụng nhiều nhất hiện nay trong phân tích và xác định các chất tự nhiên là phổ khối lượng (mass spectrometry, MS, thường được gọi là phổ khối). Phổ khối cung cấp những thông tin về khối lượng của các ion sinh ra từ phân tử.
Phổ khối không xác định trực tiếp khối lượng của ion mà xác định tỉ lệ giữa khối lượng (m) và điện tích (z) của ion (m/z). Ở các phân tử nhỏ, điện tích của ion thường là 1 nên giá trị m/z của phổ khối liên quan trực tiếp tới khối lượng của ion. Với các đại phân tử, điện tích của ion có thể lớn hơn 1. Khi đó, để xác định khối lượng phân tử (M) cấn phải biết số điện tích của ion.
Dưới những điều kiện nhất định, phân tử các chất bị mất đi electron tạo nên ion phân tử (hay còn gọi la ion mẹ) M+. Ion mẹ này có thể tiếp tục “vỡ” ra thành các mảnh nhỏ hơn là các ion con và các mảnh trung hòa. Vì khối lượng của các electron rất nhỏ, có thể bỏ qua, nên khối lượng của M+chính là khối lượng của phân tử.
Trong cùng một điều kiện ion hóa, sự phân mảnh tạo thành các ion con từ ion mẹ sẽ tuân theo những quy định nhất định. Các chất có cấu trúc tương tự nhau sẽ tạo ra những phân mảnh giống nhau. Từ khối lượng phân tử và các mảnh của phân tử, cùng với các phương pháp phổ khác người ta có thể xác định được cấu trúc của một chất chưa biết. So sánh phổ khối của một chất với phổ khối của một chất đã biết có thể giúp định danh chất đó dễ dàng và chính xác.
Khối phổ kế có thể hoạt động độc lập như một thiết bị đo phổ các chất tinh khiết hay ghép nối với các thiết bị sắc ký như sắc ký lỏng cao áp, sắc ký khí, điện di mao quản… như một detector và đồng thời cung cấp các thông tin cấu trúc.
Cấu tạo của một khối phổ kế gồm có các bộ phận chính sau: (a) Đầu vào, (b) buồng ion hóa, (c) bộ phận phân tích khối, (d) detector và (e) máy tính ghi nhậ xử lý, lưu trữ kết quả và điều khiển hệ thống. Các bộ phận từ (b) – (d) được đặt trong một buồng chân không sâu. Tùy theo từng kỹ thuật phối khổ mà cấu tạo và nguyên lý hoạt động của từng bộ phận có thể khác nhau.
3.1.Đầu vào
Đầu vào là nơi mẫu được đưa vào máy phổ khối. Mẫu có thể được đưa vào trực tiếp hay được ghép nối với đầu ra của một hệ thống sắc ký. Mẫu có thể được đưa vào dưới dạng rắn, lỏng hay khí nhưng được ion hóa trong buồng ion hóa. Cổ điển nhất là mẫu được hóa hơi. Với các kỹ thuật ion hóa mới, mẫu có thể được ion hóa trực tiếp từ dạng lỏng hay dạng rắn. Ngày nay, việc ghép nối đã trở nên dễ dàng và khối phổ đang dần trở thành một detector phổ thông cho các hệ thống sắc ký.
3.2.Buồng ion hóa
Buồng ion hóa là nơi mẫu thử được biến thành các ion để đi vào hệ thống phân tích. Hiện nay, có nhiều kỹ thuật để biến các phân tử trung hòa thành ion. Tùy từng kỹ thuật, mức độ bị ion hóa của các phân tử có thể khác nhau, từ ion hóa mạnh cho các chất dễ bay hơi và bền tới ion hóa nhẹ nhàng cho các phân tử lớn, khó bay hơi.
Cách cổ điển nhất để ion hóa các chất là kỹ thuật bắn phá electron hay sau này còn được gọi là ion hóa bằng electron (electron impact hay electron ionization, EI). Người ta dùng một chùm electron để “bắn phá” phân tử mẫu ở trạng thái hơi. Điều kiện chuẩn để thực hiện EI là 70 eV. Phổ EI thu được ở điều kiện này có thể dùng để so sánh với phổ chuẩn để xác định các chất.
EI là phương pháp ion hóa mạnh, nhiều chất trong điều kiện này bị phân mảnh đến mức không còn nhậ thấy ion M+ nữa. Để có thể phát hiện được M+, nhiều kỹ thuật ion hóa nhẹ nhàng hơn đã được áp dụng. Ion hóa hóa học (chemical ionization, CI) là một trong những kỹ thuật sớm nhất được sử dụng. Nguyên tắc của phương pháp là trong buồng ion hóa, người ta đưa vào một chất khí khác (được gọi là khí thử). Chất này sẽ bị ion hóa và các ion này sẽ tác động lên mẫu để ion hóa mẫu tạo ra M+ hay các ion cộng tương ứng. Các khí thử thường dùng trong CI là methan, isobutan hay ammonia. Quá trình ion hóa mẫu thử M với khí thử là ammonia xảy ra như sau:
NH3 + e– → NH4+ + 2 e–
NH4+ + M → NH3 + [M+H]+ Phân tử proton hóa
NH4+ + M → [M+NH4]+ Ion cộng amoni
Với CI, phổ MS thu được có số lượng các ion ít hơn và cường độ các ion cao hơn nên dễ xác định được phân tử lượng của mẫu.
EI và CI chỉ thích hợp với kỹ thuật đưa mẫu rắn (phân tích trực tiếp các mẫu tinh khiết) và khí (như GC-MS). Với dạng mẫu lỏng như trong HPLC–MS, CE-MS…các kỹ thuật ion hóa nhẹ nhàng ở áp suất thường như ion hóa phun điện (electrospray ionization, ESI), ion hóa hóa học ở áp suất thường (atmospheric pressure chemical ionization, APCI), ion hóa phun nhiệt (thermospray ionization, TS hay TSP) thường được sử dụng. Các chất dễ bị phân hủy nhiệt, khó hay không bay hơi cũng có thể áp dụng tốt bởi các kỹ thuật ion hóa này.
Với ESI, dung dịch mẫu được phun thành những hạt nhỏ vào một buồng chân không dưới một điện trường mạnh. Các giọt dung dịch bị tích điện và bay hoiw dung môi sẽ vỡ giọt thành các hạt nhỏ hơn và cuối cùng thành các ion. Các ion (dương hay âm) cần được phân tích sẽ được đẩy vào bộ phận phân tích khối. Các phân tử bị ‘vỡ’ nhẹ nhàng hơn tạo ra ít phân mảnh và có cường độ lớn hơn. Với các polymer (với M tới vài chục ngàn đơn vị khối), điện tích của các ion (z) sẽ >1 (có thể tới 20 hay hơn) do vậy vẫn có thể được phân tích trong thiết bị phổ với m/z 1000-2000.
APCI tạo ra các ion dương được proton hóa hay ion âm do loại bỏ khỏi phân tử. Dung dịch mẫu được hóa hơi bởi nhiệt độ dưới dạng phun mù và đi vào trong vùng plasma của các ion dung môi tạo bởi hồ quang ở áp suất khí quyển. Sự cho nhận proton xảy ra giữa mẫu và dung môi tạo nên các ion của mẫu thử.
Trong TSP, dung dịch mẫu được bơm dưới áp suất tương đối cao qua 1 mao quản được nung nóng bởi bằng nhiệt điện. Khi ra khỏi ống mao quản, dung môi được hóa hơi hỗ trợ cho việc phun dung dịch thành các hạt mù rồi thành các ion đẩy vào bộ phận phân tích khối. TSP có thể áp dụng cho những hệ thống có tốc độ dòng cao (HPLC). Tuy nhiên, ngày nay kỹ thuật này phần lớn được thay thế bằng ESI.
Ngoài những phương pháp ion hóa trên được sử dụng nhiều trong phân tích các hợp chất phân tử nhỏ còn có nhiều kỹ thuật ion hóa khác sử dụng cho các đại phân tử. Ví dụ, kỹ thuật bắn phá nhanh bằng nguyên tử (fast atom bombardment, FAB), các kỹ thuật giải hấp trường (field desorption, FD), giải hấp laser (laser desorption, LD) và một trong những kỹ thuật đang được sử dụng nhiều là kỹ thuật giải hấp laser hỗ trợ bởi chất nền (matrix – assisted laser desorption ionization, MALDI). Với MALDI, mẫu được trộn với dung dịch chất nền và được làm khô dung môi trên phiến kim loại rồi đưa vào buồng ion hóa của máy phổ khối chứ không kêt nối trực tiếp được với hệ thống sắc ký.
3.3. Bộ phận phân tích khối
Nhiệm vụ của bộ phận phân tích khối là phân tách hỗn hợp các ion sinh ra bởi bộ phận ion hóa thành từng loại riêng biệt theo m/z để đưa các ion này tới detector để ghi nhận phổ. Có nhiều cơ chế để tách riêng các ion như sử dụng từ trường, điện trường và vận tốc của các ion…Các bộ phận phân tích khối đang được sử dụng trong phổ khối gồm có các loại sau: cung từ (magnetic sector), tứ cực (quadrupole), bẫy ion (ion trap), thời gian bay (time of flight) và cộng hưởng bằng gia tốc ion – biến đổi Fourier (Fourier transform ion cyclotron resonance, FT-ICR).
Kinh điển nhất trong các bộ phân tích khối là thiết bị sử dụng từ trường. Dưới một từ trường mạnh, quỹ đạo các ion sẽ thay đổi và khác nhau phụ thuộc vào điện tích và khối lượng ion. Thay đổi từ trường sẽ thay đổi quỹ đạo các ion, lần lượt đưa chúng đi vào detector. Đây cũng là 1 trong 2 loại phân tích ion mạnh và có độ chính xác cao nhất được dùng trong các máy khối phổ phân giải cao (HR-MS).
Bộ phân tích tứ cực gồm 4 thanh kim loại có tiết diện tròn hay hyperbol đặt song song với nhau dài khoảng 100 – 200 mm. Một điện thế một chiều không đổi được điều biến bởi điện thế tần số radio được áp lên tứ cực tạo nên một điện trường trong tứ cực. Dưới tác động của điện trường, chỉ có những ion nhất định bay dọc theo tứ cực đi tới detector. Các ion khác quỹ đạo bị lệch và va vào các thanh tứ cực hoặc bay ra ngoài. Thay đổi dòng điện tần số radio trên tứ cực sẽ lần lượt cho phép các ion khác nhau bay vào detector và được ghi nhận thành phổ.
Bẫy ion có cấu tạo gồm một điện cực vòng với mặt trong có dạng hyperbol và hai điện cực chỏm nằm ở hai đầu trống của điện cực vòng cũng có dạng hyperbol. Bằng cách thay đổi điện thế các điện cực, người ta có thể điều khiển được quỹ đạo của các ion trong bẫy. Tuy nhiên, khác với tứ cực, các ion khi đi vào bẫy ion sẽ bị giữ tại đó bởi điện trường nếu điện thế của điện cực vòng và 2 điện cực chỏm không khác nhau. Thay đổi điện thế và tần số của điện cực vòng sẽ lần lượt quét các ion ra khỏi bẫy đi tới detector để ghi nhận thành phổ. Thay đổi thế của hai điện cực chỏm sẽ giữ lại một hay một vài ion nhất định trong bẫy (trong chế độ chọn lọc ion) hay gia tốc các ion (trong chế độ MS nhiều lần).
Tứ cực và bẫy ion cho phép phân tích các chất có m/z tới 5000. Độ chính xác khối của tứ cực và bẫy ion không cao (0,1 đơn vị khối) nhưng nhỏ gọn, đơn giản, dễ sử dụng và rẻ tiền hơn nên được áp dụng nhiều trong các hệ LC-MS.
Một cách khác để tách các ion ra khỏi hỗn hợp là dựa vào vận tốc của các ion. Ở cùng một mức năng lượng, vận tốc của ion phụ thuộc vào khối lượng của ion. Phân tử càng nhẹ vận tốc càng lớn. Đo lường thời gian để ion từ điểm xuất phát bay tới detector sẽ tính ra được khối lượng của ion. Do vậy, kỹ thuật này được gọi là xác định thời gian bay của ion (TOF). TOF có độ phân giải tương đối cao (tới 20.000), với số khối chính xác hơn (tới 0,0001). Khoảng phân tích khối của TOF là không giới hạn, rất hữu dụng cho việc phân tích các đại phân tử.
Một kỹ thuật mới để phân tích khối là cộng hưởng bằng gia tốc ion – biến đổi Fourier (FT-ICR). Các ion được giữ trong một buồng cộng hưởng dưới một từ trường mạnh ở bên và một điện trường theo hướng trục. Giống như trong cộng hưởng từ hạt nhân, tất cả các ion trong buồn được kích thích bởi một xung tần số radio băng rộng (10 KHz – 1 MHz). Các ion sẽ hấp thu năng lượng phù hợp để cộng hưởng. Các ion cùng loại khi hấp thu năng lượng (cộng hưởng) chuyển động đồng nhất tạo ra một tần số nhất định phụ thuộc vào m/z. Tất cả các tần số của các ion tạo ra sẽ được ghi nhận dưới dạng các dao động cảm ứng tự do tắt dần theo thời gian và sau đó được biến đổi Fourier để trở thành dạng phổ khối truyền thống. FT-ICR có độ phân giải và độ chính xác khối rất cao (tới 1 ppm), khoảng phân tích khối rộng (hiện nay là m/z tới 10.000). Độ nhạy của FT-ICR cũng rất cao, giới hạn phát hiện có thể đạt tới mức attomole. Khi phối hợp với ESI, FT-ICR có thể phân tích các protein tới 15.000 đơn vị khối.
Ngoài các kỹ thuật phân tích khối đã nêu trên, còn có các loại khác đã hoặc đang được phát triển như bẫy quỹ đạo (orbital trap) hay dựa trên tính linh động của ion (ion mobility) và các kỹ thuật lai hay kết hợp giữa các loại trên.
3.4. Detector
Là nơi tiếp nhận các ion và biến thành các tín hiện điện để được ghi nhận thành các tín hiệu phổ khối. Có nhiều loại detector khác nhau nhưng thường là loại ống nhân điện, ống nhân quang… các tín hiện điện thu được từ detector sẽ được số hoá và lưu trữ dưới dang các tập tin kỹ thuật số.
Trong phân tích khổ phối, việc xác định chính xác một ion (M+ hay các phân mảnh) rất quan trọng cho việc xác định chất được phân tích. Một hợp chất xác định, trong những điều kiện xác định sẽ cho các ion xác định trên phổ khối. Tuy nhiên, một ion có số khối xác định trên phổ khối lại có thể xuất phát từ nhiều chất khác nhau. Trong phân tích một hỗn hợp bằng sắc ký – khối phổ, nếu điều kiện sắc ký không đảm bảo, các chất tách ra không hoàn toàn dẫn tới phổ khối thu được sẽ có các ion của các phân tử khác làm ảnh hưởng tới việc nhận định kết quả. Trong các trường hợp này, việc xác định MS thông thường (một lần) khong cho được kết quả chính xác. Để khắc phục, người ta sử dụng các kỹ thuật khối phổ n lần với n thường là 2 hay đôi khi hơn. Kỹ thuật này được gọi là MS/MS hay MSn.
Nguyên tắc của các kỹ thuật này là lực chọn một ion xác định (thường là M+ nhưng cũng có thể là các ion con) trong các ion của lần ion hoá thứ nhất và loại bỏ tất cả các ion khác trong bộ phận phân tích ion. Các ion này sau đó được cho tiếp xúc với 1 lượng nhỏ các khí (thường là argon). Với vận tốc cao, các ion này sẽ va đập vào các phân tử khí và phân thành các mảnh nhỏ hơn. Các ion sinh ra trong lần phân mảnh thứ 2 này sẽ được phân tích và ghi nhận phổ MS. Vì phổ khối ghi nhận được chỉ từ 1 loại ion duy nhất nên không còn bị ảnh hưởng của các tạp chất trong mẫu nữa. Việc nhận định kết quả trên phổ MS/MS sẽ chính xác hơn, đặc biệt khih hàm lượng chất phân tích thấp và năm trong hỗn hợp phức tạp.
Các thiết bị để thực hiện MS/MS có 2 loại chính là: loại phổ khối nối tiếp và bẫy ion.
Loại cổ điển nhất của phổ khối nối tiếp gồm 3 tứ cực ghép nối tiếp với nhau. Tứ cực thứ nhất làm nhiệm vụ chọn lọc ion. Các ion được chọn sẽ bay vào tứ cực thứ 2 và va đập với khí argon để phân mảnh ion lần 2. Tất cả các ion tạo ra sẽ bay vào tứ cực thứ 3 và được quét lần lượt bởi điện trường để đi tới detector và ghi nhận thành phổ. Do cấu tạo bởi 3 tứ cực nên loại này thường được gọi là triplequad (triple quadrupoles).
Với bẫy ion, cả 3 giai đoạn trên đều xảy tra trong bẫy theo trình tự thời gian. Vì các ion được giữ lại trong bẫy nên việc phân mảnh có thể được thực hiện thêm nhiều lần nữa (MSn). Tuy nhiên, độ nhạy của kỹ thuật này ở các lần sau giảm đi nhanh chóng do số ion giảm. Trên thực tế, người ta thường chỉ sử dụng MS2.
Ngoài hai thiết kế cơ bản trên, còn có các loại lai khác như: Q-Trap (kết hợp giữa tứ cực và bẫy ion), Q-Tof (kết hợp giữa tứ cực và TOF), IT-Tof (kết hợp giữa bẫy ion và TOF)… Các loại thiết bị này kết nối với GC, HPLC… hiện có mặt trên thị trường.
Một phương tiện rất hữu hiệu trong phân tích các chất, đặc biệt là trong phân tích các chất có nguồn gốc tự nhiên. Phổ khối cho nhiều thông tin về các trúc để xác định cấu trúc một chất mới hay định danh một chất đã biết. Phổ khối có độ nhạy cao, khoảng tuyến tính động học rộng rất thích hợp cho phân tích định lượng, đặc biệt là trong phân tích vết. Khi kết hợp với hệ thống sắc ký, phổ khối có thể sử dụng như một detector phổ thông, phát hiện hầu hết các chất nhưng với chế độ chọn lọc ion nó lại là detector chọn lọc cho những chất xác định rất có ích trong việc định lượng các chất trong một hỗn hợp phức tạp. Các thiết bị phổ khối ngày càng nhạy và tin cậy hơn; giới hạn phân tích khối ngày càng mở rộng; việc sử dụng ngày càng dễ dang và giá thành ngày càng hạ. Điều này làm cho thiết bị khổ phối dần trở thành các phương tiện phân tích thường quy trong phân tích dược liệu.
